亞慢性全身毒性試驗
1、定義
反複或持續接觸試驗樣品後在動物(wù)壽命期的某一階段發生的不良作(zuò)用(yòng)。齧齒動物(wù)亞慢毒性研究一般為(wèi)90d，其他(tā)種屬動物(wù)在不超過其壽命期的10%的階段内。亞慢靜脈研究一般規定接觸時間為(wèi)14d~28d。
2、試驗依據
本試驗依據GB/T 16886.11 或ISO 10993-11 附錄H。
3、試驗系統
一般采用(yòng)齧齒動物(wù)（大鼠、小(xiǎo)鼠）。如采用(yòng)非齧齒動物(wù)應進行科(kē)學(xué)論證。
4、試驗步驟
4.1 樣品制備
每次試驗前，按照GB/T 16886.12 制備樣品極性浸提液和非極性浸提液。
4.2 動物(wù)試驗
将24隻動物(wù)随機分(fēn)為(wèi)浸提液組和對照組，每組雌雄各半。
從0天開始計，對大鼠進行連續14天的注射試驗，每次注射前對大鼠進行稱重并記錄，對樣品浸提液組動物(wù)尾靜脈單次注射極性浸提液，對對照組動物(wù)尾靜脈單次注射極性對照液，于1、4、7、10和13天同時進行腹腔單次注射非極性浸提液和非極性對照液，最後一次注射結束24h後安(ān)樂死解剖，見表1。
動物(wù)解剖前禁食12h，稱取空腹體(tǐ)重。麻醉後，心髒取血，分(fēn)别測定血液學(xué)、血液生化學(xué)各項指标；腹主動脈放血處死動物(wù)後，解剖觀察各個組織器官是否出現異常，稱取各髒器濕重值，計算各組織器官的髒器系數。将各髒器浸泡在10%福爾馬林固定液固定72h後，進行常規組織病理(lǐ)學(xué)檢查。
表1. 雙途徑給藥建議的劑量參數
動物(wù)數量/性别/組别a | 途徑 | 體(tǐ)積 mL/kgb | 給藥頻率 研究天數d | 注射速度 ml/min |
6 | 靜脈 | 10 | 每天注射，連續14d | ≤2 |
腹腔 | 5c | 1,4,7,10,13 | 慢速 | |
a. 溶劑對照組動物(wù)（6隻/性别）需要同樣給藥。 b. 建議的注射劑量體(tǐ)積。 c. 最好選棉籽油。 d. 給藥天數從第0天開始。 | ||||
4.3 動物(wù)體(tǐ)重
在給予樣品前即時測量動物(wù)體(tǐ)重，以及第一次接觸後的每周(如試驗周期需要)、試驗終結時測量動物(wù)體(tǐ)重。
4.4 臨床觀察
觀察頻率和間隔時間宜根據毒性反應的性質(zhì)和嚴重程度、反應速度和恢複周期來确定。在試驗的早期階段,可(kě)能(néng)需要增加觀察次數。毒性症狀出現和消失的時間、持續時間和動物(wù)死亡時間都是很(hěn)重要的，特别是出現延遲性不良臨床症狀或死亡的迹象。為(wèi)避免動物(wù)遭受不必要的痛苦，宜對動物(wù)實施國(guó)家或國(guó)際動物(wù)福利導則中(zhōng)規定的人道終點。接觸試驗樣品後基本臨床觀察應考慮預期作(zuò)用(yòng)的高峰期。
應系統記錄觀察到的現象,并保留每隻動物(wù)的觀察記錄。每天應至少一次采用(yòng)實驗室通用(yòng)臨床反應術語記錄觀察到的動物(wù)存活情況和明顯的臨床反應。長(cháng)期重複接觸研究每天應至少兩次觀察記錄動物(wù)的發病率和死亡率。更長(cháng)周期重複接觸研究可(kě)考慮至少每周一次觀察記錄更大範圍内的不良臨床症狀。
每日觀察和記錄供試品組和對照組動物(wù)的一般狀态，如皮膚、被毛、眼和粘膜改變，以及呼吸、循環、自主和中(zhōng)樞神經系統和行為(wèi)表現等狀況。采用(yòng)表2給出的描述語報告。
記錄死亡的動物(wù)數并及時進行屍檢，垂死動物(wù)及時隔離并處死。
典型的眼科(kē)檢查采用(yòng)檢眼鏡或其他(tā)同類适宜器具(jù)，宜在接觸試驗物(wù)質(zhì)之前和試驗期間進行檢查。最好檢查所有(yǒu)動物(wù)，至少檢查高劑量組和對照組動物(wù)。如檢出眼部改變，則宜對全部動物(wù)進行檢查。異常檢查宜形成文(wén)件并進行論證。
表2. 常見臨床症狀與觀察項目
臨床觀察 | 觀察症狀 | 涉及的系統 |
呼吸 | 呼吸困難（腹式呼吸、氣喘）、呼吸暫停、紫绀、呼吸急促、鼻流液 | 中(zhōng)樞神經系統（CNS）、肺、心髒 |
肌肉運動 | 嗜睡減輕或加重、扶正缺失、感覺缺乏、全身僵硬、共濟失調、異常運動、俯卧、震顫、肌束抽搐 | CNS、軀體(tǐ)肌肉、感覺、神經肌肉、自主性 |
痙攣 | 陣攣、強直、強制性陣攣、昏厥、角弓反張 | CNS、神經肌肉、自主性、呼吸 |
反射 | 角膜、翻正、牽張、對光、驚跳反射 | CNS、感覺、自主性、神經肌肉 |
眼症狀 | 流淚、瞳孔縮小(xiǎo)/散大、眼球突出、上臉下垂、混濁、虹膜炎、結膜炎、血淚症、瞬膜松弛。 | 自主性、刺激性 |
心血管症狀 | 心動過緩、心動過速、心率不齊、血管舒張、血管收縮 | CNS、自主性、心髒、肺 |
流涎 | 過多(duō) | 自主性 |
立毛 | 被毛粗糙 | 自主性 |
痛覺喪失 | 反應降低 | CNS、感覺 |
肌肉狀态 | 張力減退、張力亢進 | 自主性 |
胃腸 | 軟便、腹瀉、嘔吐、多(duō)尿、鼻液溢 | CNS、自主性、感覺、胃腸運動性、腎 |
皮膚 | 水腫、紅斑 | 組織損害、刺激性 |
4.5 病理(lǐ)學(xué)
4.5.1 臨床病理(lǐ)學(xué)檢查
4.5.1.1 試驗接觸周期内和/或接觸終結時進行血液學(xué)方面的檢查，包括：凝血（PT、APTT）、血紅蛋白濃度、血細胞比容、血小(xiǎo)闆計數、紅細胞計數、白細胞計數和白細胞分(fēn)類計數等；
4.5.1.2 試驗接觸周期内和/或接觸終結時進行臨床血液生化方面的檢查，包括電(diàn)解質(zhì)平衡、碳水化合物(wù)代謝(xiè)和肝腎功能(néng)。某些供試品由于其特定的作(zuò)用(yòng)模式可(kě)能(néng)還需測定：白蛋白、ALP、ALT、AST、鈣、氯化物(wù)、膽固醇、肌酸酐、CGT、葡萄糖、無機磷、鉀、鈉、總膽紅素、總蛋白、甘油三酯、尿氮、各種酶類等，評價免疫毒性時可(kě)考慮測定總免疫球蛋白水平。
尿液檢驗不作(zuò)為(wèi)常規檢驗，僅在預期或觀察到有(yǒu)這方面的毒性反應的情況下才考慮進行，檢驗時在實驗接觸的最後一周定時采集尿液，推薦進行一下項目檢驗：外觀、膽紅素、尿糖、酮體(tǐ)、隐血、蛋白、沉渣、比重或滲重、尿量。
4.5.2 大體(tǐ)病理(lǐ)學(xué)檢查
4.5.2.1 試驗接觸終結時，将全部試驗動物(wù)無痛處死後進行大體(tǐ)屍檢，包括體(tǐ)表及體(tǐ)表開孔、頭部、胸（腹）腔及内髒等。
4.5.2.2 将試驗動物(wù)的腎上腺、腦、附睾、心髒、腎、肝、卵巢、脾、睾丸、胸腺和子宮在取出後盡快稱量其濕重，防止幹燥以及由此造成的重量減輕。
4.5.2.3 根據供試品預期作(zuò)用(yòng)途徑選擇需進一步進行組織病理(lǐ)學(xué)檢查的器官或組織，以及供試品作(zuò)用(yòng)的靶器官、顯示有(yǒu)大體(tǐ)損害迹象或尺寸改變的器官和組織和供試品植入部位組織，取下後置于适宜的固定液中(zhōng)（10%甲醛固定液）。
應取的髒器有(yǒu)：腎上腺*, 主動脈，骨髓(股骨、肋骨或胸骨)，腦* (有(yǒu)代表性部分(fēn),包括大腦、小(xiǎo)腦和腦橋)，盲腸，結腸，十二指腸，附睾* ，食管，眼，膽囊(如有(yǒu))，心髒* ，回腸，空腸，腎* ，肝* ，肺和支氣管(經固定劑膨脹并浸入内保存)，淋巴結(局部淋巴結覆蓋接觸位置,遠(yuǎn)端淋巴結覆蓋全身作(zuò)用(yòng))，乳腺(雌性)，肌肉(骨骼)，鼻甲骨(用(yòng)于吸入研究)，神經(坐(zuò)骨神經或胫骨神經,最好貼近肌肉)，卵巢* ，胰腺，甲狀旁腺，腦垂體(tǐ)，前列腺，直腸，唾液腺，精(jīng)囊，皮膚，脊髓，脾* ，胸骨，胃，睾丸* ，腺* ，甲狀腺，氣管，膀胱，子宮* (包括子宮頸和輸卵管)，陰道。
4.5.2.4 組織病理(lǐ)學(xué)檢查
很(hěn)多(duō)醫(yī)療器械使用(yòng)的是常用(yòng)材料,隻是在化學(xué)添加劑的用(yòng)量或類型、加工(gōng)或滅菌方法上有(yǒu)所不同。根據器械的可(kě)浸提物(wù)/可(kě)瀝濾物(wù)的毒理(lǐ)學(xué)風險評估,如果确定需要對其潛在的全身毒性作(zuò)用(yòng)進行生物(wù)相容性/安(ān)全性評價,可(kě)考慮進行簡化的組織病理(lǐ)學(xué)評價。在此模型中(zhōng),采用(yòng)分(fēn)層方法檢查限定數量的靶器官/組織。
限定的組織病理(lǐ)學(xué)分(fēn)析宜包括表3列出的所有(yǒu)Ⅰ層器官/組織。如果在Ⅰ層組織或同步進行的臨床病理(lǐ)(臨床生化和血液學(xué))觀察到有(yǒu)異常或可(kě)疑結果,進行Ⅱ層分(fēn)析(檢查上述全部列出的器官/組織)。
表3. 限定組織病理(lǐ)學(xué)器官清單
器官系統 | 各系統中(zhōng)的髒器/組織(物(wù)種若适用(yòng)) | Ⅰ層組織 |
循環 | 心髒、動脈、靜脈、毛細血管、血液 | 心髒 |
消化 | 口、唾液腺、食管、肝髒、胃、膽囊、胰腺、腸(十二指腸、橫結腸、升結 腸、降結腸、回腸、空腸、盲腸、乙狀結腸)、直腸、肛門 | 肝髒 |
内分(fēn)泌 | 下丘腦、垂體(tǐ)、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、松果體(tǐ)、胰 | 腎上腺 |
排洩 | 腎髒、輸尿管、膀胱、尿道、皮膚、肺、直腸 | 腎髒 |
體(tǐ)被 | 皮膚、皮下組織、頭發、指甲 | 皮膚 |
淋巴 | 淋巴結、扁桃體(tǐ)、腺樣體(tǐ)、胸腺、脾 | 脾髒 |
神經 | 腦、脊髓、神經、末梢神經、眼、耳 | 腦 |
生殖 | 卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、睾丸、輸精(jīng)管、精(jīng)囊、前列腺、陰莖 | 卵巢、睾丸 |
呼吸 | 鼻、鼻腔、咽、喉氣管、支氣管、肺 | 肺、支氣管 |
骨骼 | 股骨、肱骨、桡骨、尺骨、顱骨、胸骨、鎖骨、腓骨、胫骨、脊柱、肩胛骨、骨盆、尾椎骨、趾骨、骨髓、軟骨、韌帶 | 股骨或胸骨 |
造血 | 骨髓 | 股骨、肋骨或胸骨 |
其他(tā) | 大體(tǐ)損傷包括受試部位 | 觀察到的器官或組織 |
5、結果評價
5.1 列表給出各種試驗數據，包括試驗開始時每一試驗組動物(wù)數量、出現損害迹象的動物(wù)數量、損害類型以及每種損害類型動物(wù)的百分(fēn)率。宜統計學(xué)方法對數據進行分(fēn)析評價，但首先要考慮生物(wù)學(xué)相關性。
5.2 對重複接觸試驗中(zhōng)的發現應結合以前的研究發現、毒性作(zuò)用(yòng)方面的考慮及屍檢與組織病理(lǐ)學(xué)方面的發現進行評價。
5.3 分(fēn)析評價試驗接觸劑量與毒性反應産(chǎn)生的相關性、異常反應的發生率和嚴重程度，包括行為(wèi)和臨床性異常、大體(tǐ)損害、顯微鏡下改變、靶器官的鑒别、死亡率、以及任何其他(tā)有(yǒu)意義的一般性和特異性反應。