細胞毒性試驗（MTT）

1、前言

細胞毒性評估材料浸提液中(zhōng)潛在的生物(wù)活性物(wù)質(zhì)對培養的哺乳動物(wù)細胞（）毒性反應。

其原理(lǐ)為(wèi)黃色水溶液MTT在活細胞内代謝(xiè)性還原，生成不可(kě)溶的甲臜。活細胞的數目與甲臜溶于醇類後用(yòng)光度計測定的色度相關。

2、試驗依據标準

2.1 GB/T 16886.5 -2022 醫(yī)療器械生物(wù)學(xué)評價 第5部分(fēn)：體(tǐ)外細胞毒性試驗；

2.2 ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 6: Tests for in vitro cytotoxicity。

3、試驗系統

L929細胞。

4、試驗樣品制備

依據GB/T 16886.12制備浸提液。

5、試驗步驟

5.1 細胞培養準備

采用(yòng)酶促消化（胰蛋白酶/EDTA）将培養細胞從培養瓶中(zhōng)移出，細胞懸液在200g離心3min。用(yòng)培養基重懸細胞懸液，調整密度為(wèi)1×105個細胞/Ml，采用(yòng)多(duō)通道移液器将100μL培養基加到96孔組織培養微量滴定闆的外圍孔中(zhōng)（=1×104個細胞/孔）。

細胞孵育24h以形成半彙合單層。培養物(wù)在含5±1%的CO2培養箱中(zhōng)(37℃±1℃，濕度>90%)培養（24±2）h，使細胞生長(cháng)形成單層近融合的細胞層。

5.2 接觸培養

培養24h後，從闆孔中(zhōng)吸出培養液，另加入100μL的測試樣品浸提液、對照樣品浸提液、空白對照液和陽性對照液，所有(yǒu)劑量需要做至少六個平行。将空白加到96孔闆的左（第2列）、右（第11列）兩側。然後在(37±1)℃，含有(yǒu)5±1%的CO2，濕度>90%的環境下培養24h±2h。

5.3 觀察

繼續培養24h後，在相差顯微鏡下檢查每個闆，判定細胞接種系統誤差和對照與試驗組細胞的生長(cháng)特性。記錄試驗樣品浸提液細胞毒性作(zuò)用(yòng)導緻的細胞形态學(xué)方面的改變，但這些記錄不用(yòng)與任何細胞毒性定量測定。對照細胞的不良生長(cháng)特性可(kě)表明實驗誤差，并且可(kě)能(néng)會因此放棄該試驗。

5.4 添加MTT

檢查平闆闆孔細胞生長(cháng)情況後，小(xiǎo)心地從闆孔中(zhōng)吸除培養介質(zhì)，在每個測試闆孔中(zhōng)加入50μL的MTT溶液（用(yòng)不含酚紅的完全MEM培養液配置成1mg/mL），在(37±1)℃條件下培養(2±0.2)h。棄去MTT溶液，每孔加入100μL異丙醇溶解甲臜，震蕩平闆，然後在570nm波長(cháng)下測量每孔的吸光度值（參照波長(cháng)650nm）。

5.4 數據分(fēn)析

活細胞數減少導緻了樣品中(zhōng)代謝(xiè)活性降低，這直接與生成的藍紫色甲臜量有(yǒu)關。測試樣品與空白對照（細胞直接與浸提介質(zhì)接觸）比較細胞存活率的降低可(kě)用(yòng)以下公(gōng)式計算：

式中(zhōng)：OD570e---測試樣品、陽性對照、陰性對照各組測得平均吸光度值。

OD570b---空白對照組（細胞直接與浸提介質(zhì)接觸）平均吸光度值。

存活率較低時，試驗樣品潛在的細胞毒性較高。如存活率下降＜空白的70%，則魚油潛在的細胞毒性。試驗樣品50%浸提液的存活率相同或較高，否則宜重複試驗。